前言

嵌合抗原受体（CAR）是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-T细胞治疗在血液恶性肿瘤取得了巨大的成就。2017年，美国食品药物监督管理局（FDA）首次批准了两种CAR-T疗法，即tisagenlecleucel（Kymriah®）和Axicabatagene ciloleucel（Yescarta®），分别用于治疗急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。到目前为止，已有6种CAR-T疗法得到了批准。CAR-T细胞疗法作为癌症治疗方面革命性的生物技术产品，展现出未来征服癌症的卓越潜力。

【资料图】

然而CAR-T细胞仍存在一些不足，例如副作用、毒性、T细胞耗竭，并且在实体瘤的治疗中显示出很低的疗效等。目前，以CAR技术为核心的新型细胞疗法，CAR-NK、CAR-NKT、CAR-巨噬细胞（CAR-M）、CAR-Treg、CAR-γδT等异军突起，在免疫治疗中展现出广阔的前景。

CAR-Treg

Treg是T细胞的一个子集，占CD4+T细胞总数的5-10%，具有维持体内平衡和预防自身免疫的功能，其特征是CD4、CD25、FOXP3和低水平CD127的共同表达。高水平的FOXP3和特异性去甲基化区域（TSDR）的去甲基化是Treg的显著特征，TSDR是FOXP3基因中的一个保守区域。

与TCR-Treg相比，CAR-Treg具有一些独特的优势：这些表达CARs的T细胞激活时绕过HLA限制，通过共受体信号的激活增加了特异性，以及CARs的靶向灵活性（任何可溶性或表面多价抗原都可以作为靶点）。

CAR-Treg细胞最直接的应用是GvHD和器官移植排斥反应。与大多数自身免疫性疾病不同，移植中有非常明确的靶点，即HLA分子。2016年，首次报道了HLA-A2CAR Treg细胞，研究证明，HLA-A2-CAR-Treg细胞抑制Teff细胞增殖，并在免疫缺陷NSG小鼠模型中阻止了HLA-A2+PBMC介导的GvHD。

通过鉴定合适的靶抗原，CAR-Treg的应用可以扩展到更多的自身免疫性疾病，如自身免疫性肝病（AILD）、I型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病等；此外，CAR Tregs也已用于治疗其他疾病，如血友病A、白癜风、哮喘、心血管疾病和衰老相关疾病。

CAR-γδT

γδT细胞是先天性T淋巴细胞的一个亚群，含有由γ链和δ链组成的TCR。它们占循环T细胞的0.5-5%，与αβT细胞相比，它们表现出更少的克隆扩增和TCR多样性。人类外周血γδT细胞主要表达Vδ2链和Vγ9链，在识别磷酸化抗原（PAG）时被激活，具有强大的抗肿瘤细胞溶解活性。γδT细胞通过不同的机制和受体发挥其强大的抗肿瘤活性：它们分泌细胞毒性分子，如穿孔素和颗粒酶，或表达凋亡诱导配体，如TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）和Fas配体（FasL），以直接杀死肿瘤细胞。

CAR-γδT的临床前研究发现，在体外与阴性的CAR-γδT细胞相比，带有CD19特异性CAR-γδT细胞增强了对CD19+肿瘤细胞的杀伤，在小鼠模型中减少了CD19+白血病异种移植物。目前，一些临床研究正在进行中。CAR-γδT细胞有望成为一种新型的γδT细胞免疫疗法。

CAR-MAIT

粘膜相关不变T细胞（MAIT）是一种独特的、进化上保守的、先天样T细胞亚群，在肝脏和粘膜组织中富集。MAIT细胞表达半不变的αβTCR，其识别由非多态性MHC I类相关分子MR1呈递的非肽抗原。作为一种非经典的细胞毒性T细胞亚群，MAIT细胞通过分泌穿孔素、颗粒酶B、表达TRAIL和FasL或产生促炎细胞因子，如IFN-γ、TNF、GM-CSF和IL-17，与中性粒细胞、巨噬细胞和其他效应T细胞相互作用，显示出强大的细胞毒性活性。

MAIT细胞具有一些有利的特性，使其成为CAR的优秀候选者。首先，它们在人体组织中含量丰富，占肝脏淋巴细胞的45%。它们在人类成年血液中也有很多，占循环T细胞的10%。其次，MAIT细胞具有内在效应记忆表型（CD45RA-CD45RO+CD62LlowCD161+),具有在激活时迅速产生免疫反应的能力。第三，由于组织归巢标记物（CCR5、CCR6、CCR9和CXCR6）的高表达，它们对外周组织具有内在的迁移能力。鉴于MAIT细胞主要存在于肝脏和粘膜相关的外周组织中，如肺、胃肠道、结肠和宫颈，在这些组织中发生的癌症可能更适合基于MAIT细胞的治疗。此外，由于MAIT细胞是不受MHC限制的，它们不太可能诱导GvHD，因此作为异基因免疫疗法开发的平台具有巨大潜力。

临床前研究表明，靶向CD19和HER2的CAR-MAIT表现出与其CAR-T对应物相似的细胞毒性，在某些情况下具有显著更高的细胞毒性，同时具有更好的安全性。然而，目前还没有注册的临床试验测试CAR-MAIT。

CAR-NKT

NKT细胞是脂质和糖脂反应性T淋巴细胞的一个子集，共表达与NK细胞相关的标记物（NKp46，NK1.1）。NKT细胞在肿瘤免疫监测和抗肿瘤免疫中起着重要作用。与MHC I或II识别肽抗原的传统T细胞不同，NKT细胞识别通过MHC I样分子CD1d呈递的内源性和外源性糖脂。

iNKT细胞具有几个有利的特性，包括通过直接细胞毒性或αβT细胞交叉启动发挥强大的抗肿瘤功能；有效运输到肿瘤部位的天然能力；以CD1d依赖的方式破坏TAMs和髓系衍生抑制细胞（MDSCs）的抑制活性；通过NKRs以独立于CD1d的方式对TAMs的识别和细胞毒性杀伤；以及由于缺乏MHC参与而没有GvHD的风险。

目前，靶向CSPG4、GD2和CD19的CAR-NKT细胞已经开发出来，靶向GD2和CD19的CAR-NKT细胞正在进行临床试验。一项I期临床试验（NCT03294954）已经开始，检测难治性神经母细胞瘤中的抗GD2 CAR-NKT细胞的疗效和安全性。初步结果表明，10名入选患者的治疗是安全的，其中1名完全缓解，1名部分缓解，3名患者病情稳定。CD19 CAR-NKT细胞正在进行一项I期临床试验（NCT03774654），检测复发和难治性B细胞恶性肿瘤中的安全性和有效性。

CAR-NK

CAR-NK与CAR-T相比，NK细胞通过另外两个共刺激分子，即NKG2D和CD244（2B4）增加其细胞毒性能力和细胞因子的产生。因此，比CAR-T细胞具有更强的肿瘤特异性靶向性和细胞毒性。CAR-NK细胞疗法可能在未来成为CAR-T疗法的替代方案，因为CAR-NK细胞具有以下超越CAR-T的几个独特特征。

首先，异基因NK细胞对于过继性细胞治疗（ACT）是相当安全的，因为它们通常不介导发生GVHD。此外，NK细胞仅分泌少量IFN-γ和GM-CSF，不产生启动CRS的IL-1和IL-6。其次，除了通过单链抗体识别肿瘤表面抗原来抑制癌细胞外，NK细胞还可以通过多种受体识别各种配体来抑制癌细胞，例如自然细胞毒性受体（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。最后，NK细胞在临床样本中非常丰富，可以从外周血（PB）、脐带血（UCB）、人类胚胎干细胞（HESC）、诱导多能干细胞（IPSC）甚至NK-92细胞系中产生。

目前，在临床研究方面， CD19-CAR-NK细胞对血液系统肿瘤有很高的应答率。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK细胞临床研究也针对CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有几种针对血液恶性肿瘤的CAR-NK细胞临床试验正在进行中。

还有多项针对实体瘤的研究处于启动或招募阶段。

CAR-M

鉴于CAR-T细胞治疗的成功和CAR-NK细胞的发展潜力，研究人员对开发用于肿瘤免疫治疗的CAR巨噬细胞（CAR-M）产生了极大的兴趣。CAR-M的出现为治疗实体瘤开辟了新的可能性：用特异性CARs修饰人巨噬细胞，以提高巨噬细胞对肿瘤的吞噬活性和抗原呈递。

CAR-T治疗实体瘤无效的一个重要原因是T细胞难以进入肿瘤组织。这是因为实体瘤细胞外基质（ECM）形成的物理屏障阻止了T细胞进入肿瘤组织。ECM由高度有序的纤维分子、糖蛋白和其他大分子产生，其合成和降解主要受基质金属蛋白酶（MMPs）和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）的调控，而巨噬细胞就是MMP的重要来源。

目前，在临床方面，两个基于CAR-M策略的临床试验已经获得FDA的批准。第一个是来自CARISMA Therapeutics的候选药物CT-0508，它用抗HER2的CAR-M治疗复发/难治性HER2过度表达的肿瘤患者（I期临床试验）。另一个是Maxyte的MCY-M11，它利用mRNA转染PBMC表达靶向间皮素的CAR（包括CAR-M），治疗复发/难治性卵巢癌和腹膜间皮瘤患者，目前正在招募志愿者进行I期临床试验。

CAR-Neutrophils

中性粒细胞，以CD11b+CD16+CD66b+为特征，占到了循环中淋巴细胞的50-70%，在先天免疫反应中发挥基础作用。中性粒细胞也积聚在许多类型的肿瘤中，构成肿瘤浸润细胞的重要部分。考虑到中性粒细胞与巨噬细胞的相似性和共同的先天抗肿瘤反应，在CAR工程化后，中性粒细胞也可能表现出增强的抑瘤活性。

已有的研究表明，经改造表达含有CD3ζ细胞内结构域的HIV特异性嵌合免疫受体（CIR）的中性粒细胞对转染HIV包膜的肿瘤细胞显示出改善的细胞毒性。然而，由于中性粒细胞对基因修饰具有抗性，寿命短，目前还没有注册的临床试验测试CAR特异性中性粒细胞。

CAR-HSPC

造血干/祖细胞（HSPCs），定义为CD34+细胞，通过自我更新和分化为成熟血细胞系，对终身维持造血至关重要。CAR对人HSPC的修饰为多个造血谱系的抗原特异性细胞提供了长期维持。转导的HSPCs将在1-2周内产生粒细胞和单核细胞，随后在几个月内产生NK细胞，并可能在更长的时间内产生T淋巴细胞。这些细胞的CAR表达可能通过不断生成的效应细胞类型的混合来实现持久的抗肿瘤免疫。

有研究用抗CD19 CAR转导CB衍生的HSPCs，然后将其分化为髓系细胞或NK细胞。他们观察到，由抗CD19 CAR修饰的HSPC产生的髓系细胞在体外对CD19阳性肿瘤细胞表现出特异性细胞毒性。体内实验还表明，CAR HSPCs可以产生多谱系CAR修饰的细胞，这些细胞可以在异种移植物模型的骨髓、脾脏和外周血中检测到。然而，目前还没有注册的测试CAR特异性HSPCs的临床试验。

CAR-iPSC

为建立长期免疫记忆的CAR技术产生无限量T细胞供应，并避免在原代T细胞体外扩增过程中出现的耗竭，一种方法是使用人类诱导多能干细胞（iPSC）作为起始材料。从几乎任何体细胞中获得iPSC的可能性、无限量生产iPSC的可及性以及iPSC基因修饰的可行性使其成为CAR技术的极富吸引力的细胞来源。

Fate Therapeutics公司开发了两种CAR iPSC衍生T细胞产品，FT819和FT873。在FT819中，一种携带CD3ζ和CD28共刺激结构域的新型抗CD19 CAR被插入到TRAC基因的两个等位基因中，以实现均匀的CAR表达，并通过使TCR无效来消除GvHD的可能性。FT819在体外B-ALL异种移植物模型中显示出有希望的结果，目前是第一种接受临床研究的iPSC衍生T细胞疗法（NCT04629729）。

参考文献：

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2. Chimeric antigen receptornatural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. JHematol Oncol.2021; 14: 73.

3.Natural Born Killers: NK Cells in Cancer Therapy. Cancers (Basel). 2020 Jul 31;12(8):2131

4. CAR-macrophage: A newimmunotherapy candidate against solid tumors.Biomed Pharmacother.2021 Jul;139:111605.

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